Multiplex pcr là gì

  -  

Thuật ngữ PCR là viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đấy là một phản ứng nhân bạn dạng DNA dựa vào các chu kỳ luân hồi nhiệt. Bài viết này nhằm mục đích trình làng những ban bố quan trọng về kỹ thuật PCR cũng như những vấn đề thường xuyên gặp gỡ khi thực hiện kỹ thuật này.

Bạn đang xem: Multiplex pcr là gì

 

KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?

 

Thuật ngữ PCR chỉ một phản ứng nhân bản DNA dựa trên những chu kỳ sức nóng. Phản ứng ra mắt trong một ống nghiệm nhỏ tuổi chứa hỗn hợp bội phản ứng (Điện thoại tư vấn là PCR mix). Trong PCR phối đã cất các thành phần:

1) Polymerase độ chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này còn có ánh sáng chuyển động buổi tối ưu làm việc 72 oC.2) 4 một số loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là vật liệu nhằm tổng thích hợp ra những bản sao DNA.3) DNA cất trình từ bỏ mục tiêu (Template): Đôi khi vào xét nghiệm thì đấy là DNA thu thừa nhận từ mẫu mã phải xét nghiệm.4) Cặp mồi quánh hiệu (Primer): Đây là những đoạn oligo-nucleotide lâu năm khoảng trăng tròn nucleotide và bắt cặp bổ sung quánh hiệu đến 2 đầu trình từ phương châm nên nhân phiên bản.5) Cation Mg2+ (MgCl2): đấy là co-factor đặc biệt quan trọng nhằm Taq polymerase chuyển động kết quả.6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Cung cấp môi trường xung quanh thuận lợi mang lại phản bội ứng nhân phiên bản diễn ra.

 

Ống nghiệm đựng PCR mix sẽ tiến hành đặt vào trong buồng ủ của sản phẩm luân nhiệt (Thermo cycler), nghỉ ngơi đất nước hình chữ S thì thường xuyên Điện thoại tư vấn luôn là lắp thêm PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của dòng sản phẩm PCR vẫn biến đổi theo chu kỳ, dựa vào đó mà quá trình nhân bạn dạng DNA được diễn ra (xem video).

 

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

 

Một chu kỳ luân hồi nhiệt độ của PCR sẽ gồm 3 quá trình ánh sáng (Hình 1):

1 - Giai đoạn biến hóa tính: Nhiệt độ sẽ được gửi lên 94 oC, các links hydro sẽ bị phá tan vỡ khiến DNA bị phát triển thành tính phát triển thành dạng mạch đơn.

Xem thêm: 72 Quán Ăn Gì Ở Đà Nẵng Webtretho, Bỏ Túi 14 Quán Ăn Ngon Đà Nẵng “Ăn Là Ghiền”

2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, những đoạn mồi đang bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình từ bỏ kim chỉ nam.3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase đã sử dụng dNTP. để kéo dãn dài đầu 3" của mồi và tạo thành mạch bổ sung cập nhật.
*
Hình 1. Chu trình nhiệt độ của một tiến trình PCR

Như vậy, cứ đọng qua 1 chu kỳ luân hồi nhiệt, số mạch DNA sẽ tiến hành nhân song. Nếu chu kỳ nhiệt độ lặp lại liên tiếp 30 - 40 lần thì số bạn dạng sao đã là 230 ~ 240 phiên bản sao. Số lượng bạn dạng sao DNA khổng lồ này Lúc được gắn thêm các phân tử phạt bộc lộ (ví dụ Ethidium Bromide) hoàn toàn có thể nhìn thấy bởi đôi mắt thường bên trên gel năng lượng điện di bên dưới ánh đèn UV (Hình 2).


1527453158292/Agarose-gel-electrophoresis-analysis-stained-with-ethidium-bromide-of-PCR-products.png" alt="*">
Hình 2. Ảnh chụp thành phầm PCR (giếng 1~7) bên dưới ánh sáng của đèn UVtrên gel agarose nhuộm bởi Ethidium Bromide

 

VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR

 

Nguim lý của PCR là khuếch đại DNA, vị vậy các phòng thử nghiệm áp dụng PCR thường xuyên không mau chóng thì muộn cũng trở nên bị lây nhiễm thành phầm PCR lên toàn bộ những lắp thêm, công cụ, chất hóa học. Người làm cho thí điểm đang nhận biết được thảm thảm kịch này Lúc toàn thể những lần chạy PCR các ra dương tính, của cả Lúc sử dụng mẫu là nước đựng. lúc điều này xảy ra thì chỉ bao gồm bí quyết bỏ cục bộ chất hóa học, khử lan truyền tổng thể chống thí điểm .... Tuy vậy vấn đề đó vẫn đang tái diễn sau một khoảng chừng thời gian thực hiện PCR.


*
Hình 3. Sơ vật dụng cách xử trí thành phầm PCR ngoại lây nhiễm bởi UNG

Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với những chống phân tách sinc học tập phân tử. Tuy nhiên, hiện thời các đơn vị công nghệ sẽ hoàn toàn có thể giải quyết vấn đề này một phương pháp khá có lợi (Hình 3), đó là vào yếu tố dNTP có bổ sung cập nhật thêm một không nhiều dUTP.. Các thành phầm PCR tạo nên đang luôn trường tồn một vài địa điểm là U ráng bởi T, những vị trí U này đang rất có thể giải pháp xử lý phân hủy bởi enzme UNG. Mẫu DNA thu nhận tự mẫu thật (template) sẽ không đựng U, vì vậy ủ PCR mix cùng với enzyme UNG trước khi PCR sẽ giúp đỡ phân giảm toàn cục những DNA ngoại lây lan nhưng mà không tác động đến template.

 

CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶPhường TRONG XÉT NGHIỆM

 

1) PCR solo mồi (Simplex PCR): Đây là đẳng cấp PCR truyền thống độc nhất vô nhị, áp dụng 1 cặp mồi quánh hiệu để khuếch đại 1 đoạn trình từ bỏ kim chỉ nam nhất.

2) PCR đa mồi (Multiplex PCR): Đây là kiểu dáng PCR áp dụng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch tán các trình tự kim chỉ nam khác nhau trong thuộc 1 phối bội nghịch ứng. Để kiến tạo được bội phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi áp dụng đề nghị gồm cùng nhiệt độ bắt cặp cùng những cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau tuyệt bắt cặp chéo cánh cho nhau. Dường như, cũng cần bảo đảm an toàn độ tinh tế Multiplex PCR tương tự với Simplex PCR, vấn đề đó siêu khó xẩy ra cần thường thì multiplex PCR được sử dụng ở những tế bào nuôi cấy vì chưng hôm nay con số trình từ đích đủ béo sẽ không còn yên cầu thừa hà khắc về độ nhạy.

Xem thêm: Màu Trung Tính Là Màu Gì - Ứng Dụng Của Nó Trong Thiết Kế Nội Thất Ra Sao


*
Hình 4. Sơ đồ gia dụng một các bước Nested PCR

3) PCR tổ (Nested PCR): Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi phía bên ngoài (outer primer) với cặp mồi phía bên trong (nested primer). Cặp mồi bên phía ngoài vẫn tmê say gia PCR lần 1 trước để gia công tăng con số DNA đựng trình từ bỏ đích, kế đến là cặp mồi phía bên trong vẫn ttê mê gia PCR lần 2 nhằm phát hiện tại trình từ đích (Hình 4). Kỹ thuật này áp dụng khi cặp mồi sệt hiệu mang lại trình từ bỏ đích (nested primer) tất cả độ nhạy cảm kém nhẹm.

4) RT-PCR: Là các bước áp dụng lúc trình tự đích là RNA, lúc này bắt buộc một bước thực hiện enzyme reverse transcriptase nhằm đưa RNA thành cDNA trước khi PCR, quy trình tiến độ này call là tiến trình RT. Kỹ thuật RT-PCR bao gồm 2 các loại (Hình 5):